经聚多巴胺涂层的羟基磷灰石生物陶瓷具有亲水(2)
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【摘要】1.4.6 聚多巴胺涂层的细胞毒性检测 将羟基磷灰石陶瓷、聚多巴胺-羟基磷灰石陶瓷置于96 孔板底,随后接种第3代人根尖乳头干细胞,接种密度为1×104/孔,
1.4.6 聚多巴胺涂层的细胞毒性检测 将羟基磷灰石陶瓷、聚多巴胺-羟基磷灰石陶瓷置于96 孔板底,随后接种第3代人根尖乳头干细胞,接种密度为1×104/孔,以单纯培养的细胞为空白组,每组7 个样本。α-MEM 培养基培养1,3,5,7 d后去除培养液,PBS洗涤3次,每孔中各加入100 μL培养基,避光加入10 μL CCK-8 液,37 ℃避光处理1 h,静置,小心吸取出培养基,转移至新96 孔板,以空白孔(培养基)调零,放置于酶标仪中测量450 nm 处的A值,按公式计算细胞相对增殖率,细胞相对增殖率=实验组平均A值/空白组平均A值×100%,计算得到每组的相对增殖率。
按照相对增殖率所对应的毒性分为:100%为0 级,75%-99%为1 级,50%-74%为2 级,25%-49%为3 级,1%-24%为4 级,0%为5 级。如果最终测得的毒性为0 或1 级,说明材料的细胞毒性低,生物相容性良好;如果最终测得的毒性为2 级,则需要配合观察分析细胞的形态判断;如果最终测得的毒性为3-5 级,说明材料的细胞毒性高,生物相容性差。
1.5 主要观察指标 羟基磷灰石生物陶瓷经聚多巴胺涂层后的理化性能和细胞毒性变化。
1.6 统计学分析 数据的分析和处理均使用统计分析软件SPSS 17.0,两者对比用t检验,P< 0.05代表差异有显著性意义。
2 结果 Results
2.1 涂层前后陶瓷的微观形貌 经聚多巴胺涂层后羟基磷灰石生物陶瓷由白色变为棕褐色。涂层前后的羟基磷灰石生物陶瓷表面均凹凸不平,疏松多孔成蜂窝状,但羟基磷灰石生物陶瓷经聚多巴胺涂层后其表面的细屑颗粒更大,表面更加平整,详见图1。未涂层陶瓷的平均孔径为(183.) μm,孔隙率为(58.)%;经聚多巴胺涂层后陶瓷的平均孔径为(182.) μm,孔隙率为(57.)%,陶瓷涂层前后的平均孔径、孔隙率比较差异均无显著性意义(P> 0.05)。
2.2 涂层前后陶瓷的亲水性 未涂层陶瓷的接触角为21.708°,经聚多巴胺涂层后陶瓷的接触角为7.561°,见图2,可见涂层后陶瓷的亲水性明显增加,表现出超强亲水性。
2.3 涂层前后陶瓷的细胞黏附 普通倒置显微镜下可见,未涂层陶瓷的细胞爬片周围散在分布人根尖乳头干细胞,聚多巴胺涂层的细胞爬片上人根尖乳头干细胞较聚集,爬片周围几乎无人根尖乳头干细胞,见图3;聚多巴胺涂层的细胞爬片上的人根尖乳头干细胞较未涂层陶瓷细胞爬片上的体积更大、更加充分伸展,细胞触角更加明显,见图4;聚多巴胺涂层细胞爬片上的细胞数明显高于未涂层组(28.,11.,P< 0.001)。
2.4 涂层前后陶瓷的细胞毒性 在两种陶瓷上培养1,3,5,7 d时,人根尖乳头干细胞的相对增殖率均在75%-100%之间,可见聚多巴胺涂层前后陶瓷均为1 级毒性,见表1,并且羟基磷灰石陶瓷组和聚多巴胺-羟基磷灰石陶瓷组不同时间点的A值比较差异无显著性意义(P> 0.05),见图5。
3 讨论 Discussion
聚多巴胺是一种天然的黑色素,所以聚多巴胺涂层使羟基磷灰石陶瓷由白色变为棕褐色,与以往的研究相一致[18-21]。聚多巴胺涂层后的细胞爬片周围几乎无散在细胞,细胞均黏附于爬片上,且其上细胞数目明显多于未涂层组,说明聚多巴胺涂层能明显提高细胞的黏附能力,这应与聚多巴胺的化学结构中所含的邻苯二酚基团相关,但这种促进细胞附着聚集的现象是否与相关因子信号方面有关还需要后续深一步的研究。虽然大多学者研究认为聚多巴胺涂层较稳定,但有学者用高效液相色谱法检测惊奇地发现,羟基磷灰石明胶硅酸钙会释放出多巴胺到周围的组织液中[22];而且有研究发现,多巴胺能够通过D2 受体抑制破骨相关基因、促炎因子表达,达到明显抑制破骨细胞的作用[23]。有研究发现,小鼠胚胎成骨细胞前体细胞会表达多巴胺D1、D2、D3、D4、D5 受体的mRNA 和蛋白,且D1、D3、D5 受体抑制剂能抑制成骨基因的表达,可见聚多巴胺并不是生物惰性的[24]。
羟基磷灰石支架经聚多巴胺涂层后其孔隙间隔、孔隙内的颗粒细屑更大,表面更加平整,可能因为聚多巴胺涂层使颗粒细屑黏合变大,使陶瓷表面粗糙度降低,从而增加了陶瓷的亲水性能,有利于提高陶瓷的生物相容性。虽然陶瓷经聚多巴胺涂层后孔径仍偏大,但聚多巴胺涂层后可解决孔径过大不利于细胞长入支架内部的难题[25-26],且提供了更广泛的三维立体生长空间,供干细胞黏附、生长并有利于细胞代谢废物与细胞所需营养物质的运输,利于细胞的增长。
表1 |各组细胞的A值与相对增殖度Table 1 |Absorbance value and relative proliferation of cells in each group培养时间 组别 A 值(images/BZ_15_1120_210_1136_236.png±s) 细胞增殖度(%) 毒性分级1 d 空白组 0. 100 0羟基磷灰石组 0. 80.04 1聚多巴胺-羟基磷灰石组 0. 78.30 1 3 d 空白组 0. 100 0羟基磷灰石组 0. 83.27 1聚多巴胺-羟基磷灰石组 0. 81.50 1 5 d 空白组 1. 100 0羟基磷灰石组 1. 88.76 1聚多巴胺-羟基磷灰石组 1. 87.25 1 7 d 空白组 1. 100 0羟基磷灰石组 1. 92.04 1聚多巴胺-羟基磷灰石组 1. 93.62 1
文章来源:《中国口腔颌面外科杂志》 网址: http://www.zgkqhmwkzz.cn/qikandaodu/2021/0414/414.html